一、原理 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物三聚氰胺的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)三聚氰胺的含量。 ? 二、試劑盒檢測限 試劑盒檢測限：???????? 10 ng/mL ? 三、?試劑盒組成 1．預(yù)包被板：96T 2．標(biāo)準(zhǔn)品液：（1mL/瓶） 0 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL 3．酶標(biāo)記物????????? 12 mL 4．抗體工作液???????  7 mL 5．底物緩沖液? ?????? 7 mL 6．底物液???????????  7 mL 7．終止液???????????  7 mL 8．20倍濃縮洗滌液??? 50 mL ? 四、樣本處理 配制樣品稀釋液： 稱取89.5 g Na2HPO4?12H2O ，蒸餾水定容至1000 mL。 ? 濕的寵物食品萃取方法（稀釋100倍） 1．勻質(zhì)樣品到布丁狀； 2．稱取2 g樣品加入10 mL 60％甲醇水溶液，并劇烈振蕩； 3．超聲萃取1 min，漩渦混合1 min，然后靜止5 min，使樣品分層； 4．5000 r/min室溫離心5 min，用玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將其收集于干凈試管中； 5．用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋； 6．取50 μL進(jìn)行實(shí)驗。 ? 干的寵物食品萃取方法（稀釋200倍） 1．均質(zhì)干的寵物飼料樣品； 2．稱取1 g樣品加入10 mL 60％甲醇水溶液，并劇烈振蕩； 3．超聲萃取1 min，漩渦混合1 min，然后靜止5 min，使樣品分層； 4．5000 r/min室溫離心5 min，用玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于干凈試管中； 6．用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋； 7．取50 μL進(jìn)行實(shí)驗。 ? ? 液態(tài)奶/乳飲料（稀釋5倍） 1．? 準(zhǔn)確吸取1 mL液態(tài)奶或乳飲料于干凈離心管中，冷藏至4℃?zhèn)溆茫?2．? 將1 mL液態(tài)奶或乳飲料樣品置于離心機(jī)中，5000 g離心10 min（建議10℃低溫離心），分離樣品中脂肪； 3．? 棄上層脂肪，取0.2 mL離心后的脫脂液態(tài)奶或乳飲料試樣于干凈試管中； 4．? 加入0.8 mL樣品稀釋液于離心后的脫脂液態(tài)奶或乳飲料中，振蕩混勻樣品，取50 μL進(jìn)行實(shí)驗。 奶粉（稀釋25倍） 1． 稱取1 g奶粉樣品于干凈試管中； 2． 加入5 mL的45～50℃溫水溶解奶粉并混勻后冷藏至4℃?zhèn)溆茫?3． 取1 mL溶解好的奶粉試樣于離心管中，5000 g離心10 min（建議10℃低溫離心），棄上層脂肪，取0.2 mL試樣于干凈試管中； 4．加入0.8 mL樣品稀釋液于試管中，振蕩混勻取50 μL進(jìn)行實(shí)驗。 酸奶：（稀釋5倍） 1． 準(zhǔn)確吸取1 mL液態(tài)奶或乳飲料于干凈離心管中，將PH值調(diào)至6～8，冷藏至4℃?zhèn)溆茫?2． 將1 mL樣品置于離心機(jī)中，5000 g離心10 min（建議10℃低溫離心），棄上層脂肪，取0.2 mL試樣于干凈試管中； 3． 加入0.8 mL樣品稀釋液于試管中，振蕩混勻取50 μL進(jìn)行實(shí)驗。 初乳樣品：（稀釋1倍） 直接法：將樣品4℃冷藏30 min后，4000 r/min離心15 min，棄去上層脂肪，取50 μL進(jìn)行實(shí)驗。 ? 五、操作步驟 1．將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～26℃）下平衡30min以上，將需用的板條放入支架，按順序編號； 2．洗液配制：將50 mL濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋至1000 mL備用（或按需量稀釋）； 3．在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50 μL待測樣品，然后每孔加入50 μL抗體（加入標(biāo)品和樣品時無時間差的影響），輕拍混勻，37℃下孵育40 min； 4．倒出孔中的液體，用洗板機(jī)洗滌4～6遍；沒有洗板機(jī)的用戶可用300 μL洗液充入各孔中，靜置20 s，倒出孔中的液體，將微孔架倒置，在吸水紙上連續(xù)拍打3次以上，以保證完全除去孔中的液體，重復(fù)操作4～6遍； 5．加入酶標(biāo)記物100 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃ 環(huán)境中反應(yīng)20 min，取出重復(fù)洗板步驟； 6．顯色：每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，置37℃ 環(huán)境中反應(yīng)10 min； 7．測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻．設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處，測定每孔OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。 ? 六、 結(jié)果判定 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。 ? 七、 注意事項 1．試劑及樣本沒有回到室溫（20～26℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低； 2．洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作； 3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象； 4．反應(yīng)終止液為2 mol/L**，避免接觸皮膚。 5．將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下； 6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑； 7．顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之，0濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值小于0.6時，表示試劑可能變質(zhì)； 8．該試劑盒比較好反應(yīng)溫度為37 ℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。 ? 八、儲藏條件和保質(zhì)期 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。